Evoluzione della divisione longitudinale nei batteri multicellulari della famiglia delle Neisseriaceae

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4853 (2022) Citare questo articolo

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I batteri a forma di bastoncino tipicamente si allungano e si dividono per fissione trasversale. Tuttavia, diverse specie batteriche possono formare cellule a forma di bastoncino che si dividono longitudinalmente. Qui, studiamo l'evoluzione della forma cellulare e della modalità di divisione all'interno della famiglia delle Neisseriaceae, che comprende specie coccoidi e bastoncini Gram-negativi. In particolare, i batteri dei generi Alysiella, Simonsiella e Conchiformibius, presenti nel cavo orale dei mammiferi, sono pluricellulari e si dividono longitudinalmente. Usiamo la genomica comparativa e la microscopia ultrastrutturale per dedurre che la divisione longitudinale all'interno delle Neisseriaceae si è evoluta da un antenato a forma di bastoncino. Nelle specie multicellulari che si dividono longitudinalmente, le cellule vicine all'interno dei filamenti multicellulari sono attaccate dal loro peptidoglicano laterale. In questi batteri l'inserzione del peptidoglicano non appare concentrica, cioè dalla periferia della cellula al suo centro, ma come un foglio mediale che ghigliottina ogni cellula. Infine, identifichiamo i geni e gli alleli associati alla multicellularità e alla divisione longitudinale, inclusa l'acquisizione del gene amiC2 che codifica per l'amidasi e i cambiamenti di aminoacidi nelle proteine tra cui MreB e FtsA. L'introduzione di amiC2 e la sostituzione allelica di mreB in una specie a forma di bastoncino che si divide per fissione trasversale si traduce in cellule più corte con setti più lunghi. Il nostro lavoro fa luce sull’evoluzione della multicellularità e della divisione longitudinale nei batteri e suggerisce che i membri della famiglia delle Neisseriaceae potrebbero essere buoni modelli per studiare questi processi grazie alla loro plasticità morfologica e trattabilità genetica.

L'allometria delle associazioni animale-microbo suggerisce che 1025 procarioti prosperano sugli animali e 1023 sugli esseri umani1,2. Tuttavia, la morfologia e la modalità di crescita degli animali simbionti sono poco esplorate3. Sebbene molti possano formare biofilm (vedi ad esempio rif. 4, 5), i batteri filamentosi segmentati intestinali (SFB6,7,8) e tre generi di Neisseriaceae che si trovano nella cavità orale (ad esempio, Alysiella, Simonsiella e Conchiformibius9,10,11 ,12), sono gli unici simbionti animali conosciuti che possono essere considerati multicellulari, cioè formano invariabilmente filamenti stabili di più di due cellule. Gli SFB si verificano nell'intestino tenue di diversi animali e svolgono un ruolo primario nella resistenza ai patogeni e nell'omeostasi intestinale13,14. A differenza della SFB, le Neisseriaceae della cavità orale multicellulare sono relativamente poco studiate. Sono strettamente imparentati con le altre ≈30 specie di Neisseriaceae presenti, per la maggior parte, nella cavità buccale dei vertebrati a sangue caldo. Sono coltivabili e alcuni sono geneticamente trattabili15,16. Oltre ad essere multicellulari, le Neisseriaceae possono essere a forma di bastoncino (ad esempio, Neisseria elongata) o coccoide (ad esempio, i patogeni umani Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae). Le cellule di Alysiella filiformis sono lunghe 2 µm e larghe in media 0,6 µm e formano palizzate erette sull'epitelio squamoso della bocca, in modo che ciascuna cellula abbia un polo prossimale attaccato all'epitelio ospite e un polo distale libero (Fig. . 1, 2b e Figura 2a-d supplementare). Inoltre, all'interno di ciascun filamento, le cellule di A. filiformis appaiono accoppiate (Fig. 2b, Figure supplementari 1c e 2a). Per quanto riguarda Simonsiella muelleri e Conchiformibius steedae (precedentemente noto come Simonsiella steedae11) sono più sottili, ma possono essere lunghi rispettivamente fino a 4 e 7 µm. A differenza di A. filiformis, entrambi i poli di S. muelleri e C. steedae sono attaccati alla bocca11,17. Ciò conferisce alle cellule di S. muelleri e C. steedae una morfologia curva (o a forma di mezzaluna) e d'ora in poi ci riferiremo ai loro poli attaccati all'ospite come prossimali e alla loro cellula media come alla loro regione più distale (Fig. 1, 2c, d ; Figure supplementari 1d, e e 2d–f).

Il miglior modello evolutivo per ciascuna partizione è stato trovato da IQ-TREE versione 1.6.381 e anche l'analisi filogenetica di massima verosimiglianza è stata eseguita utilizzando IQ-TREE82 utilizzando 10.000 repliche di bootstrap ultraveloci83. Sopra il nome di ciascuna specie, le immagini al microscopio elettronico a scansione ne mostrano la morfologia. Azzurro scuro e chiaro: Neisseriaceae coccoidi; verde: Neisseriaceae a forma di bastoncino; rosso: Neisseriaceae multicellulare a divisione longitudinale (MuLDi). I lignaggi coccoidi 1 e 2 sono indicati in blu. I lignaggi MuLDi 1 e 2 sono indicati in rosso. N.: Neisseria; U.: Uruburuella; S.: Simonsiella; R.: Alysiella; K.: Kingella; C.: Conchiformibio; S.: Snodgrassella; V.: Vitreoscilla; E.: Eikenella; C.: Crenobacter. Crenobacter spp. servito come gruppo esterno. In assenza di immagini al microscopio elettronico, la morfologia della specie è stata definita come a forma di bastoncino in base al ceppo di riferimento descritto nei rif. 94 per K. negevensis95, per K. bonacorsii96, per K. denitrificans97, per E. longiqua ed E. haliae98, per Crenobacter luteus99, per C. cavernae100, per C. sedimenti101, per C. intestinal.

96%. To assure the quality of the genomic database and to simplify the genomic comparisons, we then selected one genome for each species based on (1) completeness and circularization status, and (2) possibility to morphologically characterize it by either using a strain we have in our collection or by literature search (in the case of morphologically characterized reference strains). These 75 genomes have been used for the construction of a core genome-based phylogeny (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 3). Of note, although most of the genomes available in the NCBI database are from coccoid Neisseria (lineage 1; dark blue in Fig. 1, representing 34 species), the detailed phylogenetic analysis of this lineage, which evolved from an ancestral rod16 and includes the well-known pathogens N. meningitidis and N. gonorrhoeae, will be presented elsewhere (Bernet and Veyrier, unpublished data). In this manuscript, we therefore focused on the analysis of the remaining 41 species (Fig. 1, Supplementary Data 1)./p>

1), the observed increase in septum length suggests that the genetic events identified by comparative genomics have participated in the rod-to-MuLDi Neisseriaceae transition./p> 8 and separated by barcodes using guppy_barcoder (version 5.0.11 + 2b6dbff). The genome assembly was made by 3 programs: Canu (https://github.com/marbl/canu), Flye (https://github.com/fenderglass/Flye)73 and Miniasm (https://github.com/lh3/miniasm)74. Then each ensemble was corrected in bases using Pilon (https://github.com/broadinstitute/pilon)75. Racon (https://github.com/isovic/racon)76 Medaka (https://github.com/nanoporetech/medaka). All assemblies and assembly corrections were analyzed with Quast (https://github.com/ablab/quast)77 and BUSCO (https://gitlab.com/ezlab/busco)78. The assembly with the least number of contigs and the greatest completeness was chosen./p> 96%. To simplify the analyses and to assure their quality (such as avoiding multiple contigs) a reference genome was selected in each group. A complete circular genome from a reference strain was preferred when possible (see Supplementary Data 1). All genomes were annotated with Prokka v1.14.579 providing the annotation files for further analysis. A nucleotide-level multifasta alignment of those genes included in the core-genome of Neisseriaceae family was performed with MAFFT by using the -e–mafft options within Roary v3.11.280. A minimum percentage of 50% identity, and occurrence in 80% of the isolates was also considered by entering the -i 50 -cd 80 options, respectively, to the Roary command line. Under these parameters, a total of 401 genes were finally included in the core-genome (see Supplementary Data 3). The resulting alignment was used for the subsequent phylogenetic analysis. Best evolutionary model was determined by ModelFinder within IQ-TREE version 1.6.381. The best-fit model according to the Bayesian Information Criterion (BIC) was GTR + F + R10. Maximum-likelihood phylogenetic analysis was also performed with IQ-TREE82 using 10,000 ultrafast bootstrap replicates83. The final phylogenetic tree was drawn with FigTree v1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) and rooted in Crenobacter. The results of this analyses are provided in Supplementary Data 6. The phylogenetic tree displayed in Fig. 1, and csv file associating genome name with morphology were used in PastML with default parameters to assess ancestral morphology. The prediction method was maximum-likelihood-MPPA (marginal posterior probabilities approximation), F81 model./p> 8, they were separated by barcodes using guppy_barcoder (version 5.0.11 + 2b6dbff). In parallel, the ten indicated genomes were annotated with Prokka v1.14.579. Using each of the protein sequences (.faa) files, a standalone BLASTP87 was performed for each dyad possibility. Network connection was thereafter established with the python programming package NetworkX version 2.6.252 with a cut-off of 60% of similarity. Basically, all proteins showing more than 60% similarities with one of the members (putative homologs) were clustered together. Each cluster of proteins was named (example NEISS_1) and this name was used to replace the original locus-tags in the .GFF file (previously generated by Prokka). This was done using an homemade python script and has generated a new file that we called .GTF. This file was used to map the reads to the corresponding genomes using minimap288. The .GTF and .sam files were used to perform the reads counts using featureCounts v2.0.1 of Subread package89. The count files for each sample were joined into a table using a homemade script and these results were analyzed using DESeq2 version 3.1490. Parameter used were Reads >1 in the 10 genomes (core-transcriptome: genes that were showing at least one read mapped in all genomes). We investigated the biological functions of the gene differentially expressed and the putative pathways that could link them through a STRING analysis91./p>